（本文作者：河北医科大学基础医学院 张然等）
    生命科学的发展离不开研究手段(主要是分离、分析、测试手段)的创新和发展, 而分析方法的发展也推动了生命科学的研究向更高、更深入的层次进展。随着现代分析仪器的发展, 色谱作为分离、纯化、制备手段的意义, 起到越来越重要的作用,它在药物分析研究、中药现代化,分离及药效和药代学研究[ 5 ]中的应用日益普遍, 已经受到极大关注。生物色谱法( biochromatography)于20世纪80年代中后期出现, 是由生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。近年出现的类生物膜的评价系统, 如: 脂质体/水系统、磷脂膜色谱( IAMC) 、微乳液色谱、胶束色谱等亦是生物色谱法的扩展。
    1　脂质体毛细管电泳( liposome cap illary electro-horesis, LCE)随着生物膜色谱( biomembrane chromatography)的发展, 脂质体成为近年来较为活跃的研究领域。生物膜色谱是一种新型液相色谱模式, 它以天然或人工膜模拟生物膜为固定相, 主要用来研究溶质分子与生物膜间的相互作用。目前, 最常用的生物膜固定相是固定化脂质体, 因为磷脂是构成生物膜的3种主要成分之一。脂质体( liposome)又称为磷脂囊泡( vesicle) , 是由天然磷脂形成的微球, 具有与细胞膜相似的脂质双层结构和生物膜的流动性特征。这种人工模拟的生物膜体系不仅可以精确地模拟生物膜的化学环境,而且其物理性能也可以通过调节温度、pH、离子等得到有效控制。脂质体被视为最接近天然生物膜的简单理想的模型, 并以毒性低、制备简单、可使药物包裹入脂质双分子层, 避免药物的降解,可实现药物靶向给药等特点, 而被广泛作为药物载体使用。
    固定化脂质体色谱具有许多优点, 但是它的应用并不广泛, 主要原因是柱子制备比较困难、成本高。其次高效液相色谱(HPLC)常用的硅胶基质及其化学键合固定相的pH使用范围较窄(pH 2～8) ,色谱柱容易被污染而且很难被再生, 流动相需要大量有机溶剂, 成本高, 并污染环境。与固化脂质体色谱相比, LCE具有制备简便、溶剂消耗少、进样小、成本低等优点。1995年Zhang等首次提出了LCE的概念, 至今已经得到了较快发展, 在方法学和应用方面都有了比较深入的研究。
    2　磷脂膜色谱( immobilized artif ic ia l membranechroma tography, IAMC)磷脂膜色谱是固态基质上的有序磷脂分子单层体系,采用色谱学方法模拟药物与细胞膜相互作用过程。可用来评价药物的渗透性和活性。硅胶表面上的磷脂单分子层模拟了单层细胞膜,因此药物的磷脂膜色谱保留行为可用于预测药物与细胞膜的相互作用。目前考察药物跨膜转运的模型主要有正辛醇/水系统、脂质体/水系统、反相色谱以及磷脂膜色谱。与前述3种系统比较,磷脂膜色谱除了具有高效、简便等特点外,还能模拟药物与生物膜之间疏水作用力以外的其他作用力,因此对磷脂膜的研究也越来越深入。由于细胞膜渗透性对其有效性和安全性起着关键作用,因此磷脂膜色谱在新药研发早期阶段的介入可以有效地降低后期候选药物的淘汰率,提高新药的研发效率。
    3　微乳液电动色谱(m icroemulsion electrok ineticchroma tography,MEEKC)
    微乳液是由表面活性剂与助表面活性剂共同组成的界面膜稳定的一种以上的液体微滴所构成,微乳液电动色谱是以微乳液为运行介质的一种毛细管电泳(CE)新技术, 是Watarai于20世纪90年代创立的。它是一种具有色谱分离机制的电泳方法, 其分离原理除了基于被分析物的电泳淌度差异性之外, 主要还基于被分析物在水连续相和微乳液滴分散相之间的分配差异性。MEEKC可同时分离分析离子和中性化合物, 比一般CE可分析对象的范围更宽。在微生物、蛋白质及芳烃类等强疏水性化合物的分离上, MEEKC比MECC具有更高的柱效和更强的分离能力。
    MEEKC的分离机制也决定了它成为测定化合物油水分配系数的方法之一, 由于化合物在微乳液中的微观两相中的分配性质, 可模拟化合物在本体溶液中的分配行为。国外学者认为, 可根据化合物在微乳两相中的分配而引起电泳迁移行为的差异进行油水分配系数之一的正辛醇/水分配系数的对数值( logPcw ) 的测定。用MEEKC 技术测定化合物logPcw比其他一些方法简单、快速, 在某些情况下, 其测量精确度也更高。
    4　胶束电动毛细管色谱( m icellar electrok ineticcap illary chroma tography,MECC)MECC是在缓冲溶液中加入表面活性剂, 将色谱技术和电泳技术相结合, 结束了HPCE不能分离中性粒子的历史。以十二烷基硫酸钠( SDS)为例,它是一种阴离子表面活性剂, 当其浓度高于临界胶束浓度(CMC)时形成带负电荷的胶束, 胶束在电场的作用下向正极泳动。在中性和碱性条件下, EOF的速度比胶束迁移速度快, 因此, 胶束的实际移动方向与EOF一致(指向负极) 。待测粒子依据疏水性的不同在水相和胶束相之间进行多次分配, 其中疏水性强的中性粒子与胶束结合比较牢固, 洗脱时间较长, 可与水溶性较好的中性粒子分离。在MECC中, 中性粒子的分离机制是其与胶束间的相互作用, 而对于带电离子则同时有电泳迁移、静电作用、两相分配等多种分离机制。在新胶束应用研究方面, 除SDS和22O2羰基甲基2β2环糊精及四环己基高氯酸外, Nishi等直接用胆酸盐作胶束剂,因天然胆酸是光学异构体, 用其作手性化合物拆分获得较大成功。Nishi等用同样条件分离了8种皮质激素, 7种羟基苯甲酸酯(甲酯至异戊酯)和12种地尔硫的同系物,前二类分离很好,后者较差,但用作单一组分定量(RSD, 2.5% )和杂质检查十分理想。Nishi等还用同一胶束剂拆分了地尔硫同系物及Trimetoquinol对映异构体。Le等应用胶束电动色谱对类维生素A进行了分离。总之,MECC技术现在正如HPLC, 迅速进入药物分析领域, 而且分离效果好、速度快、费用低, 但是如何使其成为一种常规分离技术尚需进一步研究。
    5　胶束液相色谱(m icellar liquid chroma tography,MLC)
    胶束液相色谱又称拟相液相色谱或假相液相色谱(p seudophase LC) ,是一种新型的反相液相色谱技术,与胶束电动毛细管色谱(MECC)相似。将表面活性剂加入HPLC的流动相(有机流动相)中,形成反胶束,用带有反胶束的流动相作为洗脱液的HPLC被称作胶束液相色谱。
    胶束液相色谱方法特点: ① 高度选择性———因分离组分与胶束之间存在着静电、疏水以及空间效应的综合作用,只要通过流动相中胶束浓度的改变,就可使分离选择性获得改善。此外,通过适当固定相以及表面活性剂的选择也可提高分离选择性。②便于梯度洗脱———由于表面活性剂的浓度高于CMC后,再增大浓度时,溶液中仅胶束的浓度发生改变,而表面活性剂单体分子的浓度不变,不影响流动相与固定相的平衡过程,因而比传统的梯度洗脱技术大大缩短了分析时间,并减少了流动相的消耗,适用于常规操作。③高灵敏度———胶束流动相可增加某些化合物的荧光强度,从而提高检测灵敏度。还可稳定某些化合物在室温条件下发生的液体磷光。因分离组分不易分出,故缺点是柱效低且不适于制备分离。
    胶束的存在提高了HPLC的分辨率, 同时调整了溶质的保留时间, 因此MLC可以用来分析含有更多组分的药物分子的混合物Gonzalo-Lumbreras等通过MLC成功地检测了存在于尿液中的各种甾体类激素的合成代谢物和分解代谢物。除此之外, MLC可以用来直接测定血样中小分子药物的含量, 而不需血样前处理。因为反胶束的存在可以将血液中的水溶性蛋白包在其极性核内而被除去。Elisa等通过直接进样(血样)并用MLC方法实现了对几种巴比妥酸盐的同时检测。除了用于药物分析外, Molero2Monfort等认为, 药物主动转运的难易程度, 主要由药物本身的物化性质决定, 而保留时间正是药物物化性质的综合体现, 所以通过对药物MLC保留时间的测定, 可以预测药物的吸收状况, 并根据模拟定量-保留-活性关系(QRAR)模型, 有效的预测某些药物(局部麻醉药、儿茶酚胺、巴比妥和苯并二氮等)的生物学活性。在MLC系统中, 化合物的保留依赖于化合物的疏水、电子和空间特征。因此, 该技术能够用来描述和预测药物在体外的生物学反应, Molero2Monfort为拓展MLC的应用开辟了新思路。
    6 　生物分配胶束色谱( b iopartition ing m icellarchroma tography, BMC)BMC是胶束液相色谱(MLC)的一种方式。该胶束液相色谱使用表面活性剂在生理条件(pH, 离子强度)下形成的胶束作为流动相。可用于模拟药物在生物系统的分配过程。
    BMC可以有效预测药物口服吸收。Molero-Monfort等在此方面做了大量研究。受试药物为不同结构的主要以被动吸收为主的74种药物,覆盖了一定宽度的口服吸收范围(A%: 16% ～100%) ,以及药物的理化性质, 如疏水性范围( logP: 0.34～5.20)及不同电荷(酸性、碱性及中性) , 流动相为0.04 mol·L - 1 B rij-35溶液, 在两种pH值(pH 7.4:模拟血浆; pH 6.5: 模拟小肠)下得出的KBMC与口服吸收值具有相似的双曲线关系。这与常用的体外膜通透性模型Caco22、PAMPA ( parallel artificialmembrane permeability assay)及原位或体内渗透模型得到的结果一致。对于以被动吸收为主的药物, 由于其在BMC上的保留, 可以根据膜转运性质将其划分为以下两类。(1) pH 6.5, 0.2 < KBMC < 3的药物在吸收速率和程度上表现出低渗透性和高度易变性, 生理因素对这类药物的影响要高于剂型因素。此外该类药物溶解度低, 不易吸收, 口服给药时将面临很多难题。(2) pH 6.5, KBMC > 3的药物具有高渗透性, 可被迅速完全吸收, A% > 90%。不过, 如果药物溶解性很好, 首过代谢可能成为限制系统生物利用度的影响因素(如普萘洛尔) 。对于溶解性差的药物, 其在胃肠道的溶解是吸收的限速步骤。剂型或生理因素都可能影响药物的溶出过程。将药物数目减少后仍然得到相似的结果, 说明该模型可以预测新药的口服吸收, 预测的可信限为±16% , 符合文献报道。比较BMC、Caco-2和PAMPA等膜通透性筛选模型, BMC具有以下优势: 色谱分配系统迅速、简单、经济, 保留数据重现性好, 在预测药物口服吸收时不需要对原系统进行校正, 大大提高了筛选速率。
    生物分离胶束色谱可以预测药物透过血脑屏障的能力, 决定了其向脑内分布的程度。Quinones-Torrelo等对抗组胺药物透过血脑屏障能力的研究表明: 抗组胺药物的保留值与半衰期( T1 /2 )和分布容积(Vd )的关系符合二次多项式模型。与文献报道的QSAR模型一致。Gilabert等应用B rij-35溶液作流动相, 成功地预测了44 种不同结构的药物(包括中性、阳离子型及阴离子型药物) 透过血脑屏障的能力。利用多元线性回归(multip lelinear regression,MLR)将药物透过血脑屏障的分配系数与BMC保留数据联系起来,并将电荷因素引入回归方程。由BMC保留数据预测的logBB与实验测得值相关, 线性关系良好( r*2 = 0.75) , 而用logP代替logKBMC虽然也能给出相同的趋势, 但统计学参数不理想( r*2 = 0.59) 。说明疏水作用对药物透过血脑屏障的作用只接近59% , 而非疏水作用(静电、空间位阻等)也参与了药物经血脑屏障的渗透。可见用BMC预测药物透过血脑屏障要优于正辛醇/水系统。目前常用一种来源于牛脑微血管的内皮细胞系(BBMEC)在体外模拟药物经血脑屏障的转运。将BMC (流动相: 0.04 mol·L - 1Brij-35)的保留数据( logKBMC )与BBMEC的渗透数据( PC ×104 )相关分析后r*2 = 0.94, 表明用BMC可以预测药物在BBMEC的渗透, 两种体外方法对于评估药物的血脑屏障穿透能力同样有效。Canós-Rius等采用生物分离胶束色谱和胶束电色谱技术评估酸碱对局部麻醉药的影响。局部麻醉药活性结构特征的测定相当困难, 但它有某些基本的结构特征。局部麻醉药属于疏水的弱碱(质子常数为7.5～8.8)性化合物, 在pH 7.4 时。离子和非离子形式穿过脂膜的轴突, 通过带电分子镶到通道内部产生麻醉作用。于是, 带电和不带电形式的比率与化合物的疏水性是麻醉阻塞效率的界定因素。另一方面局部麻醉药的药理学和毒理学作用高度依赖于生理pH已经有报道。体内的pH是由肺和肾调节的, pH值的变化影响蛋白质和许多药物的离子化程度, 正如多数离子化合物一样不容易跨细胞膜。改变pH值影响细胞的功能和许多制剂的效能。例如, 接近脓肿的酸性组织降低局部麻醉药功效。相反, 碱性与增加局部麻醉药的功效有关。首先, 确定在BMC和MEKC系统使用B rij-35作为表面活性剂( pH 7.4 )时获得的保留数据和局部麻醉药的某些药效学参数间的定量关系, 再把这些模型与固定人造膜柱( IAM)获得的模型进行比较。然后, 采用BMC在不同流动相pH7.4时的保留数据研究酸、碱对局部麻醉药的药理和毒理学的影响。另外, BMC可以分析疏水性对单胺再摄取抑制剂类抗抑郁药物的效能, 以及对单胺受体具有亲和力的中枢神经系统药物的影响, 同时还可以预测皮肤的渗透性、生态毒性和体外快速实验预测视觉组织的渗透性等。
    本研究小组为证明生物分配胶束液相色谱(MBC)修饰的固定相在结构上和生物膜相似, 以抗高血压类药物为研究对象, 系统考察了3种不同类型的表面活性剂: 阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠( SDS) , 阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)以及非离子表面活性剂聚乙氧基月桂醚(B rij-35 ) 对药物保留的影响。药物以SDS 或CTAB为流动相的胶束液相色谱中, 容量因子和药物的急性毒性参数LD50之间没有明显的相关性。而以非离子表面活性剂为流动相时, 容量因子与药物的LD50间有一定的线性相关性。表明以表面活性剂B rij-35为流动相的胶束液相色谱是较好的一种模拟生物膜的体系。这主要是由于在离子型的胶束液相色谱中, 胶束相和固定相上存在过强的负电性或正电性, 药物在这种体系下的保留主要取决于疏水和静电等作用。而生理状态下药物与细胞膜的分配作用以疏水作用为主、静电作用其次, 所以离子型胶束液相色谱适用于色谱分离而不适用于模拟药物与生物膜的作用。而非离子型表面活性剂在水中不解离, 其胶束溶液不会产生过强的电性, 在该体系中, 固定相与溶质的作用以疏水作用为主, 静电作用较弱, 更接近于药物与细胞膜的作用。因此选择非离子型表面活性剂B rij-35作流动相的胶束液相色谱可预测药物的急性毒性。
    7　展望
    当前组合化学技术及计算机辅助设计的发展,使得药物化学合成化合物的数目大大增加, 此外,中药复杂体系本身就是一个数目庞大的天然化合物库, 这都要求生物药剂学家应有一种快速筛选出具有适宜体内药代动力学特征的候选药物的工具。另外, 药物在体内的动态取决于其在其受体内的一系列跨模转运过程, 它仍需要以被动扩散机制通过其他生物膜来发挥活性, 因此在新药研发初期阶段,候选药物的膜渗透性以及与生物膜的作用特征是决定其是否适合作为先导化合物的重要信息。各种拟生物膜色谱除在分离分析方面具有一定潜力外, 更重要的这些拟生物膜与天然生物膜结构类似, 用来研究药物与拟生物膜的相互作用, 能最大程度地反映药物分子与生物膜相互作用的真实情况。这种体外实验模拟体内条件的筛选模型为药物筛选和药物设计提供了强有力的工具。拟生物膜与生物膜色谱相比, 方法简单、可操作性强、成本低廉、重现性好, 具有更好的发展前景。

来源：中国医院数字图书馆